Cytometerchippet är cirka 25 mm brett och 50 mm långt (cirka 1 x 2 tum). De två ljusblå fläckarna är de punkter där partiklar i vätskan belyses av laserljus. Två fluorescerande utsignaler från varje punkt tas av optiska länkar till höger. Det finns fem inlopp på toppen av chipet – ett för provet och fyra för att skapa vätskehöljet.
kreditera:
G. Cooksey/NIST
Att mäta antalet och egenskaperna hos celler som rör sig i flöde – en process som kallas flödescytometri – är extremt viktigt för diagnostisk medicin, farmaceutisk forskning och biomedicinska vetenskaper. Nu har forskare vid National Institute of Standards and Technology (NIST) kommit på ett sätt att göra oöverträffade förbättringar av tekniken.
Flödescytometri innebär typiskt att celler märks med ett fluorescerande material, lyser ett laserljus på dem när de korsar en specifik punkt i en vätskekanal lika stor som ett människohår – tillräckligt smal för att cellerna vanligtvis rör sig i en fil – och registrerar det ljus som emitteras från cellmarkörerna. Analys av utsläppen avslöjar olika egenskaper såsom celltyp, storlek, DNA-innehåll och stadium i celldelningscykeln.
Men den konventionella enkelmätmetoden saknar ett sätt att kvantifiera variationen i sina avläsningar. Till exempel kan en cytometer som mäter cancerbiomarkörer använda ett specifikt mätvärde för att avgöra mellan friska eller sjuka celler. En cell kan returnera ett något lägre värde, vilket identifierar den som frisk. Men intervallet av värden som instrumentet kan returnera för upprepade mätningar av denna cell är okänt.
Detta är problematiskt eftersom det inte är känt hur ofta värdet kan ge en felaktig bild av diagnosen. Till exempel är en hög grad av tillförsikt absolut nödvändigt när man räknar cirkulerande tumörceller som leder till cancermetastaser; det kan bara finnas en tumörcell för varje miljon andra i ett blodprov. Att förbättra förmågan att lösa dessa sällsynta händelser kan leda till tidigare upptäckt och bättre behandlingsalternativ.
På liknande sätt kan felaktig räkning av olika cellpopulationer, såsom immunceller, i ett prov leda till en felaktig diagnos av sjukdom eller en feltolkning av huruvida läkemedelsbehandling har varit framgångsrik. Det kan vara svårt att avgöra om olika mätningar härrör från olika celltyper eller helt enkelt från experimentell variabilitet.
För att ta itu med denna situation skapade och validerade NIST-forskare ett nytt system som direkt registrerar mängden variation i flödescytometrimätningar för att kvantifiera osäkerhet. Deras instrument tar en serie av flera avläsningar av samma partikel, vars position och hastighet kontrolleras exakt när den rör sig genom kanalen, vilket gör att de kan observera mätberoende variationer på upp till 1 %.
“Detta är första gången vi direkt kan mäta osäkerheten för något objekt i en flödescytometer”, säger Matthew DiSalvo, huvudförfattare till NIST-teamet, som rapporterar sina resultat 20 juli 2022 i tidskriften Lab på ett chip. “När du mäter något en gång och bara en gång, kan du inte verifiera noggrannheten,” sa han. “För att göra det behöver du repeterbarhet.”
Den nya seriella flödescytometern i chipsskala löser detta problem genom att ta fyra mätningar av varje partikel: två avläsningar vid var och en av två olika punkter åtskilda med 16 millimeter; (cirka 0,6 tum) i kanalen vid flödeshastigheter på upp till 100 eller fler partiklar per sekund.
Flera kritiska utmaningar var tvungna att övervinnas för att skapa den nya cytometern, som till en början testades med identiska plastpärlor med en diameter på cirka 15 mikrometer (µm, miljondelar av en meter), cirka en tiondel av ett människohår och samma storlek som t.ex. som medelstora vita blodkroppar.
En utmaning var att tillverka en kanal (ca 40 µm gånger 80 µm) som omfattar två identiska områden där laserljus appliceras på den passerande partikeln och säkerställa att den största mängden emitterat fluorescerande ljus fångas upp av ett par detektorer som mäter i båda uppströms och nedströms. För att göra detta utvecklade DiSalvo och projektledaren Gregory Cooksey avancerade vågledare som minimerar förlusten och förhindrar att det emitterade ljuset sprids. Cooksey har lång erfarenhet av banbrytande mikrofluidprojekt, och cytometerteamet drar nytta av detta arbete.
Schematiskt diagram av vätskekanalen. Varje provpartikel styrs till dess off-center jämviktsposition innan den rör sig nedför kanalen. På två separata punkter 16 mm från varandra, bestrålar en laserstråle (488 nm, blå) partikeln och dess fluorescensemission (520 nm, grön) fångas upp av detektorer (numrerade 1 till 4) i både upp- och nerriktningar längs kedjan.
kreditera:
NIST
En annan särskilt krävande utmaning var att hitta ett sätt att säkerställa att de utsläpp som registrerades i vart och ett av de två områdena i kanalen kom från samma partikel. Detta kan endast göras genom att styra partikelns position och hastighet så exakt att transittiden från en nod till den andra är exakt känd, vilket gör att systemet kan matcha mätningar vid den första noden med de vid den andra.
För att göra detta utvecklade forskarna en “hybrid” teknik för att fokusera partikeln på en specifik punkt i kanalen. I konventionella cytometrar görs detta vanligtvis genom att använda två olika vätskepumpar: en för att injicera partiklarna och en för att skapa ett separat skal av vätska runt kanalens inre omkrets, vilket effektivt bildar ett vätskerör i den fasta kanalen. Detta verkar för att begränsa provet till den centrala kärnan av kanalen.
Eller det är åtminstone antagandet. Men egentligen, sa Cooksey, i små kanaler, “det är den värsta möjliga platsen du kan sätta det.”
Anledningen är att vätskans rörelsemängd i små kanaler lägger till två krafter på partikeln. En kraft verkar för att lyfta partikeln från väggen. Men en annan kraft trycker bort partikeln från mitten av kanalen på grund av skillnaden i vätskehastighet som verkar på vardera sidan av partikeln. Som ett resultat tenderar partikeln naturligt att röra sig bort från centrum till ett jämviktsläge där krafterna är balanserade. För den specifika design som används i denna studie varierar förskjutningen från centrumlinjen med vätskehastigheten, från cirka 11 µm vid 0,75 meter per sekund till 14 µm vid 1,35 m/s.
För att styra denna position mycket exakt använde DiSalvo och Cooksey fyra pumpar för att driva höljet, vilket gjorde att de kunde justera trycket från sida till sida samt upp och ner. “Vi använder hydrodynamik för att sätta partikeln i den position vi vet att den vill gå till i början av sin transit,” sa DiSalvo. “Så när en partikel accelererar nedför kanalen är den redan i sin jämviktsposition. Detta hålls mycket hårt längs hela längden av cytometern.
Därför kan enheten göra högprecisionsmätningar med partiklar som rör sig med en hög genomströmning på 1 m/s. (1 m/s, eller cirka 2,3 mph, kan tyckas långsam. Men med den hastigheten färdas en 10 µm partikel 100 000 gånger sin kroppslängd per sekund. En bil som gör detta skulle färdas cirka 1 miljon mph.)
Sedan experimenten rapporterades i den nya tidskriftsartikeln har teamet mätt vita blodkroppar i enheten. “Det första vi tittar på är var cellen är i sin delningscykel,” sa Cooksey. “Vi tittar på hur mycket DNA som finns i cellen. Den fluorescerande signalen tillåter oss att kvantifiera hur många av cellerna som aktivt delar sig och genomgår DNA-syntes.
Forskare använder också olika laservåglängder för att avslöja olika egenskaper hos provet.
“Vi har i stor utsträckning modifierat vågledarna för att öka känsligheten genom att införliva mikrolinser och andra förbättringar,” sa DiSalvo. “Vi tror att vi snart kan tillhandahålla osäkerhetsmätningar samtidigt som vi matchar känsligheten hos kommersiella enkelmätsystem som kostar hundratusentals dollar.”
Cytometerprojektet inkluderar samarbetspartners med expertis inom matematik och modellering, vilket leder till ytterligare nya analytiska metoder som kommer att förbättra kvantifiering och klassificering. NIST-forskarna Paul Patrone och Anthony Kearsley använde signalanalys för att separera variationer i mätningar på grund av variationer i flöde och partikelstorlek. Deras metoder tillåter också en oöverträffad förmåga att identifiera och separera objekt som tidigare skulle ligga för nära varandra för att kunna särskiljas med konventionell mätning. Underlåtenhet att särskilja enskilda objekt förhindrar räkningsnoggrannhet och kan resultera i att unika komponenter i provet saknas, såsom cirkulerande tumörceller eller interagerande immunceller.
https://www.nist.gov/news-events/news/2022/07/new-device-design-brings-unparalleled-confidence-cell-measurements
